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ABSTRACT. L’obesità è associata a uno stato di infiammazione cronica di basso grado. Così, in zone metabolicamente rilevanti...

incluso il tessuto adiposo e il muscolo, vi è una produzione anomala di citochine pro-infiammatorie come il TNF-α. In questo studio sperimentale (1605 kB) gli Autori dimostrano che l’espressione di eNOS risulta ridotta, con concomitante riduzione della biogenesi e della funzione mitocondriale, nel tessuto adiposo (bianco e bruno) e nel muscolo soleo di tre differenti modelli animali di obesità. La delezione genetica del recettori 1 del TNF in topi obesi ristabilisce l’espressione di eNOS e la biogenesi mitocondriale nel grasso e nel muscolo; questo è associato a minor incremento ponderale rispetto ai controlli obesi selvatici. Inoltre, TNF-α riduce l’espressione di eNOS e la biogenesi mitocondriale in culture di adipociti (bianchi e bruni) e in cellule satelliti muscolari di topi. I donatori di NO (DETA-NO e SNAP) sono in grado di prevenire la riduzione della biogenesi mitocondriale osservata con TNF-α. Il presente studio dimostra che TNF-α altera la biogenesi mitocondriale e la funzione di diversi tessuti di roditori obesi mediante la riduzione dell’espressione di eNOS, suggerendo un nuovo processo fisiopatologico che giustifica l’obesità.


Traduzione e commento del testo

L’obesità dei giovani e degli adulti sta assumendo un carattere epidemico; l’accumulo viscerale di tessuto adiposo è spesso associato a insulino-resistenza, dislipidemia, ipertensione, con rischio di aterosclerosi evolutiva (come nella c.d. sindrome metabolica). E’ il risultato di un bilancio energetico positivo in cui sono introdotte più calorie rispetto a quante vengono utilizzate per l’ossidazione (per esempio, spesa energetica nel muscolo e nel tessuto adiposo bruno) o per la crescita e il metabolismo basale, con conseguente deposito di composti energetici nel tessuto adiposo (per esempio, accumulo di trigliceridi nel grasso bianco). L’obesità si associa a uno stato di infiammazione cronica caratterizzata da infiltrazione di macrofagi nel muscolo e nel tessuto adiposo e da produzione anomala di mediatori pro-infiammatori (tra cui TNF-α e iNOS). Questo stato infiammatorio si associa a un deficit di energia (ATP) e simultanea iperproduzione di grasso e leptina, che si accompagna a leptino-resistenza cerebrale. Gli Autori avevano già dimostrato che l’NO aumenta la biogenesi mitocondriale, il metabolismo ossidativo e i livelli di ATP in alcuni tipi cellulari. La biogenesi e la funzione mitocondriale sono marcatamente ridotti nei topi mutanti eNOS-null (eNOS-/-), che presentano accumulo di grasso addominale e aumento ponderale rispetto agli animali selvatici.

In questa ricerca si studia l’espressione di eNOS e la biogenesi mitocondriale insieme al ruolo di TNF-α in differenti modelli di obesità. Si dimostra che sia l’espressione di eNOS, sia la biogenesi mitocondriale sono ridotte nel tessuto adiposo e muscolare di topi e ratti obesi geneticamente o per condizionamento ambientale. Inoltre si osserva che la delezione genetica di recettore 1 TNF nei topi obesi è in grado di ripristinare l’espressione di eNOS e la biogenesi mitocondriale negli stessi tessuti. Ciò significa che il TNF-α altera la biogenesi e la funzione mitocondriale in tessuti metabolicamente attivi di animali mediante l’inibizione dell’espressione di eNOS. Per giungere a tali conclusioni gli Autori hanno determinato l’espressione di eNOS e la biogenesi mitocondriale in animali obesi, mediante misurazione di eNOSmRNA e di livelli proteici nel tessuto adiposo bianco (WAT) di 3 modelli animali (topi ob/ob; ratti fa/fa; topi obesi da iperalimentazione: topi DIO), riscontrando livelli inferiori rispetto ai loro rispettivi controlli selvatici (figura 1).

Gli Autori hanno poi sviluppato un ulteriore modello di obesità, in cui il segnale TNF-α era carente: topi p55-/- nutriti con dieta ricca di grassi per tre mesi (topi DIO p55-/-). L’espressione di eNOSmRNA, il consumo di ossigeno e la produzione di ATP misurati in questi topi cono stati comparati a livello dei loci del recettore TNF con controlli DIO selvatici (di pari età e sesso) e con topi nutriti con dieta standard. Tutti i 3 parametri erano significativamente più alti in WAT di topi DIO p55-/- che guadagnavano meno peso corporeo rispetto ai topi DIO selvatici. Il consumo di ossigeno e la produzione di ATP erano anche significativamente più elevati in BAT e nel muscolo soleo dei topi DIO p55-/-. Non si sono osservate differenze statisticamente significative di questi parametri in quei topi DIO p55-/- che guadagnavano peso corporeo ad un livello simile ai topi DIO selvatici (circa 30 per cento dei topi DIO p55-/-) (figura 5).

Questi risultati dimostrano che l’attività di TNF-α è il principale determinante della riduzione dell’espressione di eNOS in WAT, BAT e muscolo scheletrico, nonché della biogenesi mitocondriale nell’obesità, poiché il difetto di segnale TNF-α conferisce protezione dalla riduzione indotta dall’obesità sia di eNOS sia di funzione mitocondriale. Il recettore p55 sembra essere coinvolto nel mediare gli effetti di TNF-α. Una riduzione di eNOS e di biogenesi mitocondriale era stata anche osservata quando TNF-α era somministrato a cellule di WAT e BAT e a cellule satelliti muscolari (che sono le cellule progenitrici del muscolo scheletrico, responsabili della crescita post-natale e dei processi di riparazione) differenziate in coltura. I livelli di eNOSmRNA e di proteine erano entrambi ridotti in misura concentrazione-dipendente dall’esposizione delle cellule a TNF-α per due giorni. Questo effetto era particolarmente evidente in cellule WAT, nelle quali i livelli di eNOSmRNA e di proteine erano ridotti del 66 e del 48 per cento rispettivamente, dopo trattamento con 10nM TNF-α.

La riduzione di eNOS era parallela alla concomitante riduzione di biogenesi mitocondriale, come dimostrato dalla significativa riduzione dei livelli di mRNA di PGC-1α, NRF-1 e TFam in cellule di WAT esposte per due giorni a 1 nM TNF-α. Anche i livelli di proteine COX IV e Cyt c in cellule WAT erano significativamente ridotti da 1 nM TNF-α. La riduzione indotta da TNF-α di COX IV e Cyt c era statisticamente significativa sia in cellule BAT, sia in cellule muscolari, sebbene meno evidente rispetto a quanto osservato in cellule WAT. Le concentrazioni di TNF-α usate in questi esperimenti sono comparabili con le concentrazioni 15-48 nM presenti nel plasma di roditori magri e obesi.

Per dimostrare ulteriormente che il TNF-α peggiora la biogenesi mitocondriale, gli Autori hanno misurato il consumo di ossigeno in WAT, BAT e cellule satelliti muscolari. Una forte, interessante riduzione concentrazione-dipendente si è evidenziata in cellule WAT e in cellule satelliti muscolari trattate con TNF-α. Cambiamenti minori sono stati osservati in cellule BAT in cui, peraltro, le più elevate concentrazioni di TNF-α (10 nM) non riuscivano a modificare il consumo di ossigeno comparato con cellule non trattate. Ciò potrebbe essere dovuto a specifiche azioni di TNF-α in queste cellule, compresa la modulazione di proteine disaccoppianti che regolano la respirazione di cellule BAT. Questi risultati suggeriscono con forza che il TNF-α può essere coinvolto nella carente biogenesi mitocondriale osservata in diversi tessuti di animali obesi.

Per verificare che la riduzione di eNOS da parte di TNF-α è un meccanismo molecolare rilevante attraverso il quale è coinvolta la biogenesi mitocondriale, le cellule adipose e muscolari sono state trattate con TNF-α in presenza di due donatori di NO (DETA-NO e SNAP) che sono stati in grado di prevenire l’effetto di TNF-α sulla biogenesi mitocondriale, con pieno recupero del consumo di ossigeno e dell’espressione di PGC-1α, NRF-1, Tfam, COX IV, Cyt c nelle cellule adipose e muscolari (figura 6).

Fig. 6: la biogenesi mitocondriale è ridotta da TNF-α e ristabilita da un donatore di NO in cellule WAT. (A) eNOSmRNA e proteine sono state analizzate mediante RT-PCR quantitativa e immunoblotting, rispettivamente, in cellule non trattate (C: controlli) o dopo esposizione a TNF-α a dosi differenti per due giorni. (B) I livelli di mRNA di PGC-1α, NRF-1 e Tfam sono stati determinati in cellule WAT non trattate e dopo trattamento con 1 nM TNF-α da solo o in combinazione con 50 μM DETA-NO per due giorni. (C) Livelli proteici di COX IV e Cyt c e (D) consumo di ossigeno sono stati misurati in cellule WAT non trattate e dopo trattamento con 1 nM (C) o differenti dosi (D) di TNF-α da solo o in combinazione con 50 μM DETA-NO per due giorni. I valori relativi sono medie ± SEM (n=4 differenti esperimenti) avendo assegnato alle misurazioni dei controlli il valori di 1,0. **P<0.01, *P<0.05 versus cellule non trattate.

Nella discussione gli Autori sottolineano che la patofisiologia dell’obesità non è ancora completamente chiarita. Un metabolismo energetico cellulare deficitario può giocare un ruolo centrale: i dati del presente studio confermano che una funzione mitocondriale ridotta è compatibile con carenti ossidazioni lipidiche riscontrate in pazienti obesi. La produzione di NO eNOS-dipendente induce biogenesi mitocondriale, con un aumento concomitante dell’espressione genica di PGC-1α, NRF-1 e Tfam, consumo di ossigeno e produzione di ATP in cellule adipose e muscolari. Al contrario, topi eNOS -/- mostrano uno spiccato deficit nella biogenesi mitocondriale, sviluppando obesità viscerale e sindrome metabolica. Sono stati descritti, concordemente con l’attuale lavoro, aumenti di espressione di eNOS nel WAT addominale di topi maschi DIO e una correlazione inversa tra il contenuto muscolare scheletrico di eNOS, la percentuale di grasso corporeo e il BMI in giovani donne. In tal caso, la supplementazione dietetica con L-arginina (con aumento delle concentrazioni di NO e di espressione di PGC-1α in WAT) si è dimostrata capace di ridurre la massa grassa in ratti Zucker diabetici, 4-10 settimane dopo l’inizio del trattamento (rispetto a ratti di controllo).

A conferma che la disfunzione mitocondriale è importante nella fisiopatologia dell’obesità, sono le numerose analisi di espressione genica su larga scala effettuate in animali obesi e nell’uomo, che dimostrano che molti geni codificanti le proteine mitocondriali sono correlati negativamente con la massa corporea. Inoltre, topi con delezione genetica di NEIL1 DNA glicosilato (un enzima coinvolto nella riparazione di basi di eliche frammentate) hanno maggiori danni di mtDNA con delezioni, sviluppando obesità severe, dislipidemia, epatosteatosi e tendenza all’iperinsulinemia. Pazienti obesi, oltretutto, hanno carente energia sotto forma di ATP: bassi livelli di ATP sono associati ad aumento di appetito e minor capacità d’esercizio fisico, con maggior affaticamento.

Recentemente la capacità di sforzo aerobico al treadmill è stata selezionata geneticamente in diversi tipi di ratti: i corridori di bassa capacità mostravano notevole adiposità viscerale, ipertensione arteriosa, insulinoresistenza, ipertrigliceridemia e aumento degli acidi grassi liberi a confronto dei corridori ad alta capacità. E’ stimolante ricordare che, nei corridori di bassa capacità, si rilevavano disfunzioni mitocondriali, alterazioni del metabolismo ossidativi e basse espressioni di geni mitocondriali, tali da suggerire che l’obesità viscerale e le patologie ad essa correlate fossero dovute a una ridotta biogenesi mitocondriale e ad un metabolismo ossidativo con ridotta produzione di ATP.

I risultati del presente studio concordano con questa ipotesi sia a livello molecolare e biochimico, sia a livello morfologico. I mitocondri erano tipicamente larghi, rotondi o ovali, con creste ben organizzate in WAT, BAT e muscolo soleo dei topi di controllo. Al contrario, le creste mitocondriali erano pleomorfe e disorganizzate in BAT di topi obesi, sebbene la tipica forma mitocondriale fosse conservata sia in WAT, sia in BAT. Nel muscolo soleo di topi ob/ob, tuttavia, i mitocondri erano piccoli, eterogenei, allungati e ricurvi, con creste piegate. Questa morfologia, che va di pari passo con i deficit mitocondriali, suggerisce un aumento di eventi di fissione nelle dinamiche mitocondriali. In tale contesto, l’espressione di mitofusina 2 (coinvolta negli eventi di fusione mitocondriale) è stata riscontrata ridotta nel muscolo scheletrico di ratti fa/fa.

Il TNF-α, che è iperprodotto nel tessuto adiposo e nel muscolo di pazienti obesi, svolge un ruolo importante in questi processi: infatti la biogenesi mitocondriale in WAT, BAT e muscolo è almeno parzialmente ripristinata in topi obesi con difettoso segnale TNF-α. Questo parziale recupero della biogenesi mitocondriale in WAT e BAT di topi ob/ob p55-/- e ob/ob p55-/-p75 -/- era accompagnato da pieno recupero di espressione eNOS in tali tessuti. Al contrario, solo un recupero parziale di espressione eNOS accompagnava il ripristino limitato della biogenesi mitocondriale nel WAT di topi DIO p55-/-, riflettendo possibili differenze fisiopatologiche tra topi ob/ob e topi DIO.

Oltretutto il TNF-α riduce notevolmente sia l’espressione di eNOS, sia la biogenesi mitocondriale in colture di cellule adipose e muscolari. La riduzione di eNOS è il maggior meccanismo molecolare attraverso cui TNF-α agisce sulla biogenesi mitocondriale in modelli in vitro, come chiaramente dimostrato dal completo blocco degli effetti di TNF-α sui mitocondri ottenuto da donatori di NO (come DETA-NO e SNAP). Questi dati suggeriscono che, seppure non sia il solo fattore coinvolto, il TNF-α svolge un ruolo importante nel ridurre l’espressione di eNOS e la biogenesi mitocondriale in tessuti metabolicamente attivi di animali obesi. Il recettore più importante nel mediare gli effetti di TNF-α risulta essere p55. Molti studi hanno dimostrato che i macrofagi si accumulano nel tessuto adiposo in espansione, con rilascio di mediatori infiammatori, tra cui TNF-α e iNOS. L’incremento di iNOS (indotto dall’infiammazione) spesso correla con la riduzione di eNOS.

A riprova di ciò, il TNF-α aumenta l’espressione di iNOS in diverse cellule e tessuti, compresi muscolo e grasso, mentre inibisce l’espressione di eNOS, la funzione mitocondriale e la produzione energetica non solo in WAT, BAT e cellule muscolari, ma anche in cellule endoteliali, cardiomiociti e linee cellulari di fibroblasti. Recentemente si è dimostrato che il TNF-α può positivamente autoregolare la propria biosintesi nel tessuto adiposo, contribuendo al mantenimento di elevati livelli di TNF-α nell’obesità. E’ interessante notare che molti pazienti obesi mostrano elevati livelli di PCR, risultato di infezioni batteriche o fungine oltre all’aumentata produzione di TNF-α. Inoltre alcune tossine, diffuse nell’ambiente di paesi industrializzati, aumentano i livelli di TNF-α nel siero e nel fegato di scimmie esposte a tali concentrazioni ambientali, così come accade in colture cellulari di adipociti, monoliti e macrofagi. Questi risultati suggeriscono che fattori ambientali (infezioni e tossine) possono svolgere un loro ruolo nella patofisiologia dell’obesità.

Tutti questi studi suggeriscono che un’inadeguata disponibilità energetica corporea e un alterato effetto anoressizzante della leptina adipocitaria legato a leptino-resistenza conducono al cervello di pazienti obesi un segnale di “emergenza” difficile da ignorare: più energia è richiesta per sopravvivere. Come conseguenza, un paziente obeso aumenterà il proprio introito di cibo, riducendo l’attività fisica, al fine di mantenere adeguate riserve energetiche corporee. Così, sebbene iperalimentazione e sedentarietà portino all’accumulo di grasso, esse non sono le uniche basi fisiopatologiche dell’obesità. Al contrario, esse possono essere il risultato di un “metabolismo già obeso”che stimola gli individui ad iperalimentarsi per conservare energia. L’ipotesi può essere supportata dall’osservazione che mentre in ratti e topi normopeso restrizioni caloriche moderate aumentano la capacità ossidativa mitocondriale sviluppando l’espressione di eNOS e la biogenesi mitocondriale, nei pazienti obesi una restrizione dietetica abbassa ulteriormente una già ridotta ossidazione lipidica di diversi tessuti, probabilmente a causa della mancanza di biogenesi mitocondriale compensatoria NO-correlata. I risultati di questo studio, quindi, suggeriscono la necessità di approcci terapeutici alternativi all’obesità animale ed umana, compresi farmaci che possano aumentare massa e funzione mitocondriale.

Questo studio merita la massima attenzione sia per il metodo, sia per la sostanza: in particolare, va sottolineata l’estrema correttezza del ragionamento scientifico con il quale sono stati condotti i vari esperimenti. Gli Autori, con un procedimento pragmatico lineare, riescono a riconoscere le evidenze biologiche su cui basare le loro conclusioni; dall’esame, poi, delle osservazioni di laboratorio, derivano le loro deduzioni che, confrontate con la letteratura e con precedenti esperienze degli stessi ricercatori, permettono di giungere a conclusioni estensibili alle basi fisiopatologiche dell’obesità umana, stimolando la comunità scientifica alla prosecuzione delle indagini finalizzate ad interrompere quei meccanismi di automantenimento di questa condizione patologica che, purtroppo, non consentono di avere un approccio vincente nei confronti del cronico eccesso ponderale.


Bibliografia

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